Studie zaměřená na identifikaci genetického materiálu (DNA) mikroorganismů Lactobacillus spp., Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae metodou polymerázové řetězové reakce v reálném čase pro diagnostiku bakteriální vaginózy.
Ruská synonyma
Bakteriální vaginóza, DNA [polymerázová řetězová reakce v reálném čase], kvantitativní analýza.
Synonyma Anglicky
Bakteriální vaginóza, DNA [polymerázová řetězová reakce, real-time PCR], kvantitativní, qRT-PCR.
Metoda výzkumu
Polymerázová řetězová reakce v reálném čase.
Jednotky měření
GE/ml (genomové ekvivalenty na mililitr).
Jaký biomateriál lze použít pro výzkum?
Obecné informace o studiu
Bakteriální vaginóza je patologický proces, který se vyskytuje především u žen v reprodukčním věku a je charakterizován změnami ve složení a poměru vaginální mikroflóry. Je častou příčinou abnormálního výtoku, může být spojen s rozvojem zánětlivých onemocnění pánevních orgánů u žen a zvyšuje riziko nákazy sexuálně přenosnými infekcemi. Rozvoj bakteriální vaginózy také zvyšuje riziko rozvoje těhotenských patologií: předčasný porod, spontánní potrat, nízká porodní hmotnost, rozvoj poporodní endometritidy, vaginitida. Je třeba poznamenat, že u 50 % žen může být bakteriální vaginóza asymptomatická.
U zdravých žen v reprodukčním věku je celkový počet mikroorganismů ve vaginálním výtoku 10 7 -10 9 CFU/ml (jednotky tvořící kolonie na mililitr) a skládá se z více než 40 různých druhů. Převládající bakterie jsou Doderleinovy bacily a laktobacily (Lactobacillus spp.): L. crispatus, L. jensenii, L. acidophilus, L. brevis. Udržují stálost biochemického složení a mají ochrannou funkci. Laktobacily mají schopnost přeměňovat glykogen na kyselinu mléčnou a produkovat peroxid vodíku, který pomáhá udržovat konstantní vaginální pH a snižuje kyselost. Zároveň je potlačován růst oportunní mikroflóry. U bakteriální vaginózy je pozorována dysbióza, porucha poměru a zvýšený růst oportunních, fakultativně anaerobních, anaerobních bakterií a mykoplazmat. Mezi tyto mikroorganismy patří Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Prevotella spp., Mobiluncus spp., Ureaplasma urealyticum a řada dalších. Snížení počtu laktobacilů a nadměrný růst oportunních mikroorganismů vede k poruchám, které se mohou klinicky projevit jako zánět poševních stěn – vaginitida, doprovázená silným svěděním, pálením a abnormálním výtokem.
Nejběžnější mikroorganismy, které přibývají při bakteriální vaginóze, jsou: Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae. Gardnerella vaginalis je podmíněně patogenní mikroflóra pochvy a je fakultativním anaerobem. Mikroorganismy jsou detekovány u 95–99 % žen s bakteriální vaginózou, včetně jejího opakovaného průběhu. Nadměrná reprodukce gardnerella vede k vytěsnění Lactobacillus spp., který za normálních podmínek převládá ve vagíně. a stimuluje přemnožení anaerobních bakterií a mykoplazmat. Riziko rozvoje gardnerelózy zvyšuje vaginální výplach, užívání nitroděložní antikoncepce a IUD, chlamydiová nebo gonokoková infekce atd. Atopobium vaginae je grampozitivní anaerobní bacil, který se vyskytuje u 99–100 % pacientek s bakteriální vaginózou. Hraje roli při vzniku zánětlivých onemocnění pánevních orgánů u žen a často se vyskytuje u recidivujících bakteriálních vaginóz. Detekce těchto mikroorganismů hraje důležitou roli při včasné diagnostice bakteriální vaginózy, včetně jejího asymptomatického průběhu, prevenci komplikací a také při stanovení správné patogenetické terapie.
Diagnostika bakteriální vaginózy je založena na kombinaci klinických projevů a údajů z laboratorních testů. V laboratorní diagnostice je důležité určit druhové složení poševní mikroflóry a stanovit poměr mikroorganismů. V tomto případě se stanoví počet bakterií Lactobacillus spp. a další mikroorganismy.
Mezi moderní diagnostické metody patří polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RT-PCR). Jedná se o molekulární diagnostickou metodu, která umožňuje identifikaci genetického materiálu studovaného patogenu. Vyznačuje se vysokou mírou diagnostické senzitivity a specificity a rychlostí získání konečného výsledku. Zvláštností metody je schopnost detekovat DNA (deoxyribonukleovou kyselinu) bakterií i při nízkém jejich obsahu ve studovaném biologickém materiálu. Metoda je založena na mnohonásobném zvýšení počtu kopií oblasti DNA specifické pro daný patogen. V tomto případě se provádí kvantitativní hodnocení DNA bakterií (celkový počet bakterií), Lactobacillus spp., Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae s analýzou poměru koncentrací těchto mikroorganismů. Metoda se používá k diagnostice bakteriální vaginózy, včetně jejího asymptomatického průběhu, u žen s těhotenskými patologiemi, s rozvojem zánětlivých komplikací po těhotenství, jakož i při předepisování a sledování terapie. Při vyhodnocování výsledků RT-PCR jsou detekovány fragmenty DNA živých i zničených mikroorganismů, takže výsledek testu zůstane nějakou dobu pozitivní, i když byla léčba správně zvolena.
K čemu slouží výzkum?
- Pro kvantitativní detekci DNA patogenů Lactobacillus spp., Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae.
- Stanovit poměr množství DNA patogenů Lactobacillus spp., Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae.
- Pro diagnostiku etiologie bakteriální vaginózy a jejích komplikací.
- Předepsat patogenetickou terapii bakteriální vaginózy a posoudit kontrolu podávané léčby.
Kdy je studium naplánováno?
- V případě klinických projevů bakteriální vaginózy (patologický výtok z pochvy, svědění, pálení), stejně jako v případě jejího asymptomatického průběhu.
- Při rozvoji komplikací bakteriální vaginózy, těhotenská patologie: předčasný porod, spontánní potraty, nízká porodní hmotnost dítěte, rozvoj poporodní endometritidy, vaginitida.
- Při předepisování a sledování probíhající léčby bakteriální vaginózy.
Co znamenají výsledky?
Bakteriální DNA: větší nebo rovna 10^6 GE/ml.
Lactobacillus DNA: ne méně než koncentrace DNA bakterií.
DNA Gardnerella vaginalis: nepřekračuje koncentraci DNA Lactobacillus.
DNA Atopobiumvaginae: nepřekračuje koncentraci DNA Lactobacillus.
Výsledky se vystavují se zprávou lékaře.
- přítomnost DNA mikroorganismů Lactobacillus spp., Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae;
- bakteriální vaginóza způsobená nerovnováhou v poměru patogenů Lactobacillus spp., Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae.
- nepřítomnost bakteriální vaginózy způsobené nerovnováhou v poměru patogenů Lactobacillus spp., Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae.
Důležité poznámky
- Při vyhodnocování výsledků RT-PCR jsou detekovány fragmenty DNA živých i zničených mikroorganismů, takže výsledek testu zůstane nějakou dobu pozitivní, i když byla léčba správně zvolena.
Také doporučeno
[09-007] Gardnerella vaginalis, DNA [PCR v reálném čase]
[09-116] Analýza vaginální mikrobiocenózy. 16 indikátorů, DNA kvantitativní [real-time PCR]
[09-117] Analýza vaginální mikrobiocenózy. 8 indikátorů, DNA kvantitativní [real-time PCR]
[10-048] Kultura Gardnerella vaginalis
[10-055] Studie vaginální mikrobiocenózy se stanovením citlivosti na antibiotika
Kdo si studium objedná?
Gynekolog, porodník-gynekolog, urolog, terapeut, praktický lékař.
Literatura
- Kusters JG, Reuland EA, Bouter S, Koenig P, Dorigo-Zetsma JW. Multiplexní test PCR v reálném čase pro rutinní diagnostiku bakteriální vaginózy // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2015 září;34(9):1779-85.
- Oakley BB, Fiedler TL, Marrazzo JM, Fredricks DN. Rozmanitost lidských vaginálních bakteriálních komunit a asociace s klinicky definovanou bakteriální vaginózou // Appl Environ Microbiol. 2008 srpen;74(15):4898-909.
- Bradshaw CS, Tabrizi SN, Fairley CK, Morton AN, Rudland E, Garland SM. Asociace Atopobium vaginae a Gardnerella vaginalis s bakteriální vaginózou a recidivou po perorální léčbě metronidazolem // J Infect Dis. 2006. září 15;194(6):828-36.
Nerovnováha v mikrobiotě urogenitálního traktu žen způsobená oportunními mikroorganismy je charakterizována změnou kvalitativního a/nebo kvantitativního složení normobioty, metabolickými a imunitními poruchami a v některých případech klinickými projevy. Běžným projevem závažné nerovnováhy bioty je bakteriální vaginóza.
Úplná identifikace etiologické struktury onemocnění umožní včasnou diagnózu, identifikaci komplikovaných forem onemocnění a v souladu s tím provedení cílené adekvátní terapie, a to i v časném stadiu, ještě před rozvojem komplikací.
Metoda je založena na komplexním kvantitativním hodnocení bioty pomocí real-time PCR (RT). Provádí se srovnání mezi počtem konkrétních zástupců normo- a oportunní patogenní bioty a celkovým počtem mikroorganismů za účelem identifikace nerovnováhy bioty, stupně její závažnosti a zjištění etiologické role konkrétních mikroorganismů v jejím rozvoji. podléhají kontrole kvality klinického vzorku pro výzkum.
Metoda umožňuje objektivní posouzení v krátkém časovém období:
- Kvalitativní a kvantitativní složení bioty;
- Rozlišovat mezi stavy fyziologické rovnováhy a nerovnováhy;
- Kontrolujte kvalitu odběru biologických vzorků.
Indikátory analyzované pomocí sady Femoflor 16:
- Kontrola odběru materiálu
- Celková bakteriální hmota
- Lactobacillus spp.
- Enterobacteriaceae
- Streptococcus spp.
- Eubacterium spp.
- Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp.
- Staphylococcus spp.
- Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp.
- Megasphaera spp./Veilonella spp./Dialister spp.
- Lachnobacterium spp./ Clostridium spp.
- Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.
- Peptostreptococcus spp.
- Atopobium vaginae
- Ureaplasma (urealyticum + parvum)
- Mycoplasma (hominis + genitalium)
- Candida spp.
Řízení převzetí materiálu (MSC).
Nezbytnou podmínkou pro kvantitativní analýzu urogenitální bioty je správná technika odběru seškrabů z povrchu odpovídajícího biotopu (uretra, cervikální kanál, pochva). Indikátorem správného odběru biomateriálu je dostatečné množství lidské genomové DNA ve vzorku. Zdrojem této DNA jsou epiteliální buňky, které jsou obsaženy ve vzorku, pokud je technika odběru biomateriálu správná. Optimální hodnota tohoto ukazatele by měla být alespoň 105.
Ukazatel je hodnocen v absolutních hodnotách.
Celková bakteriální hmota (TBM).
Ukazatel, podle kterého lze posoudit celkový počet bakterií. Odhadem v absolutních hodnotách. Obvykle je tato hodnota 106 – 108. Hodnota BMP vyšší než 108 indikuje nadměrnou mikrobiální kontaminaci biomateriálu. Čím vyšší je hodnota TBM, tím vyšší je mikrobiální hmota ve vzorku. Hodnota TBM nižší než 105 odpovídá sníženému počtu mikroorganismů ve vzorku, což může být důsledek atrofických procesů nebo antibiotické terapie.
Posouzení normobioty.
Hlavními představiteli normální flóry urogenitálního traktu u žen v reprodukčním věku jsou zástupci rodu Lactobacillus (LB).
Hodnocení normobioty se provádí jak v absolutních hodnotách, tak ve vztahu k celkové bakteriální hmotě. Normálně se absolutní počet laktobacilů prakticky neliší od celkového počtu bakterií, to znamená 106–108
Relativní množství laktobacilů je rozdíl mezi Lg10 celkové bakteriální hmoty (TBM) a Lg10 laktobacilů (LB). Například, je-li celkový počet bakterií 107, bude Lg10 tohoto počtu roven 7. Normálně by rozdíl mezi logaritmy (řády) TBM a LB neměl překročit 0,5, což je určeno chybou metody .
Mírně snížená hladina laktobacilů – s rozdílem v logaritmech (řádech) od 0,5 do 1.
Výrazně snížená hladina laktobacilů – s rozdílem v logaritmech (řádech) větším než 1.
Čím menší je podíl laktobacilů v TBM, tím více je potlačena normální flóra.
Hodnocení aerobní a anaerobní oportunní mikroflóry.
Kvantitativní úroveň aerobní a anaerobní oportunní mikroflóry lze hodnotit v absolutních i relativních hodnotách. Absolutní množství odpovídají výsledkům bakteriologických studií. Například počet mikroorganismu Gardnerella vaginalis je 103.
Relativní množství konkrétního mikroorganismu se vypočítá ve vztahu k množství Lactobacillus spp., rozdílem mezi Lg10 laktobacily a Lg10 konkrétního mikroorganismu, podobně jako se vypočítá relativní množství samotných laktobacilů ve vztahu k celkovému počtu bakterie (TBM).
V urogenitálním traktu žen v reprodukčním věku mohou aerobní i anaerobní oportunní mikroorganismy způsobovat patologické procesy v urogenitálním traktu.
Hodnocení mykoplazmat, ureaplazmat a hub Candida.
Kvantitativní hodnocení hladiny mycoureaplasmat (Mycoplasma a Ureaplasma), jakož i kvasinkovitých hub rodu Candida, se provádí pouze absolutním množstvím. Klinicky významná hladina Mycoplasma a Ureaplasma je 104, kvasinkovitých hub rodu Candida spp – 103.
Indikace pro analýzu
- Přítomnost infekčního a zánětlivého procesu urogenitálního traktu u žen, způsobeného změnou kvantitativního a kvalitativního složení oportunní bioty;
- Preventivní vyšetření urogenitálních infekcí žen spojených s oportunní patogenní biotou
Studijní materiál
Ke studiu se používají seškraby epiteliálních buněk.
- z pochvy (posterolaterální fornices);
- močová trubice;
- cervikální kanál
Kritéria pro kvantitativní hodnocení bioty
Absolutní ukazatel je přibližný a závisí na technice odběru biomateriálu a způsobu extrakce DNA.
Relativní ukazatel je přesnější než absolutní – rozdíl v desetinných logaritmech (řádech) mezi celkovou bakteriální hmotou (TBM) a laktobacily (LB) a také mezi laktobacily (LB) a oportunními patogeny (OPM).
normocenóza
Stav normocenózy je charakterizován následujícími ukazateli:
- Celková bakteriální hmota je na normální úrovni.
- Normoflora (Lactobacillus spp.) má normální hladinu.
- Mykoplazmata: Mycoplasma hominis a Ureaplasma (Urealiticum + Parvum) chybí nebo mohou být přítomny v množství, které nemá žádnou diagnostickou hodnotu
- Aerobní a anaerobní oportunní flóra chybí, má normální hladinu, jednotliví zástupci oportunní mikroflóry mohou mít hladinu mírně zvýšenou.
- Plísně rodu Candida chybí nebo mohou být detekovány v množství, které nemá žádnou diagnostickou hodnotu.
Středně těžká dysbióza
- Stav středně těžké dysbiózy je charakterizován následujícími indikátory:
- Celková bakteriální hmota je na normální úrovni.
- Normoflora (Lactobacillus spp.) má normální nebo mírně sníženou hladinu.
- Mykoplazmata: Mycoplasma hominis a Ureaplasma (Urealiticum + Parvum) mohou být přítomny v diagnosticky významném množství.
- Aerobní a anaerobní oportunní flóra: některé oportunní bioty mají mírně a středně zvýšené hladiny.
- Houby rodu Candida mohou být přítomny v diagnosticky významném množství.
Těžká dysbióza.
Stav výrazné dysbiózy je charakterizován následujícími indikátory:
- Celková bakteriální hmota může být normální, zvýšená nebo snížená.
- Normoflora (Lactobacillus spp.) může chybět, mít normální, středně nebo výrazně sníženou hladinu.
- Mykoplazmata: Mycoplasma hominis a Ureaplasma (Urealiticum + Parvum) mohou být přítomny v diagnosticky významném množství.
- Aerobní a anaerobní oportunní flóra: většina zástupců oportunní mikroflóry má mírně nebo výrazně zvýšenou hladinu.
- Houby rodu Candida mohou být přítomny v diagnosticky významném množství.
Etiologická struktura zjištěné nerovnováhy:
Anaerobní, pokud je nerovnováha způsobena anaerobními mikroorganismy: Gardnerella vaginalis /Prevotella bivia/Porphyromonas spp; Atopobium vaginae; Eubacterium spp; Sneathia spp/Leptotrihia spp/Fusobacterium spp; Megasphera spp/Veilonella spp/Dialister spp; Lachnobacterium spp/Clostridium spp; Mobiluncus spp/Corynebacterium spp; Peptostreptococcus spp
Aerobní, pokud je nerovnováha způsobena aerobní mikroflórou: Enterobacteraceae, Streptococcus spp a Staphylococcus spp.
Smíšené, pokud je nerovnováha způsobena jakoukoli kombinací aerobní, anaerobní flóry a hub Candida.
Infekční proces způsobený houbami Candida může probíhat bez dysbiotických poruch na straně oportunní flóry a může být také kombinován s dysbiózou.
Ženy by se měly den předem zdržet mytí genitálií a sprchování. Vyšetření proveďte 48 hodin po kolposkopii, 24 hodin po ultrazvukovém vyšetření vaginální sondou, 2 týdny po nasazení probiotik, eubiotik, 4 týdny po nasazení antibiotik, 10 dní po použití lokálních antiseptik. Nedoporučuje se darovat během menstruačního cyklu.